活性炭在水中增強(qiáng)脂肪酶催化反應(yīng)

　　在工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用中，活性炭已被用于固定酶。近期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化酶水解對酶納米顆粒生產(chǎn)中活性炭的吸附功能。活性炭的關(guān)鍵特性是其高孔隙率、吸附能力和獨(dú)特的表面積，這使其成為適合去除各種化合物的吸附劑。本研究活性炭作為支持材料在水溶液中增強(qiáng)脂肪酶催化反應(yīng)的作用，低共熔溶劑作為共溶劑。研究了碳化溫度、浸漬比和碳化時(shí)間對脂肪酶活性的影響。

　　活性炭形態(tài)

　　測量了活性炭的表面積和孔隙特征。在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察活性炭的表面形貌。放大1000倍的活性炭表面形貌如圖1所示。研究了活性炭的N2吸附-脫附等溫線，結(jié)果表明活性炭的微孔體積有利于為脂肪酶固定化提供更多的活性位點(diǎn)。這次制備的活性炭微孔體積適合脂肪酶吸附，也證實(shí)了微孔體積結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)來自水炭的廣西人的平均孔寬為3.55，證實(shí)了NaOH活化形成中孔碳的趨勢。假設(shè)增加活化劑與水炭的比例會增加活化劑在水炭表面的蝕刻深度，將更多的微孔轉(zhuǎn)化為中孔。NaOH活化增強(qiáng)了活性炭表面的發(fā)展和均勻性。完成了組織良好的孔結(jié)構(gòu)的形成。酶和支持物的形狀、大小和結(jié)構(gòu)變化通常通過識別和表征支持物來確定。良好的機(jī)械性能和大的表面積可以容納足夠的酶，擴(kuò)散最少。

　　圖1：制備的活性炭在1000倍放大倍率下的SEM圖像(10µm尺度)。

　　活性炭對脂肪酶活性的影響

　　使用十三個(gè)活性炭樣本，篩選了兩種類型的脂肪酶，脂肪酶和豬脂肪酶。在2mL離心管中，將緩沖液與1mL游離脂肪酶或活性炭/脂肪酶樣品混合。在對照樣品中，以1:1的比例使用在磷酸鹽緩沖液中制備的脂肪酶溶液(1mL酶在1mL緩沖液中濃度為0.5mg/mL)，而對于脂肪酶樣品，使用1:1使用1mL酶溶液對1mL低共熔溶劑的比例。在繼續(xù)以下步驟之前，對所有樣品進(jìn)行渦旋。所有樣品都標(biāo)記為A1至A13，然后相應(yīng)地加載0.1g活性炭。將溶液在恒溫混合器中以350rpm孵育2小時(shí)。離心2分鐘(8000轉(zhuǎn)/分)后收集上清液。圖2顯示了脂肪酶和豬脂肪酶在活性炭固定化后的相對活性，在進(jìn)行脂肪酶測定之前將所有樣品孵育2小時(shí)后。添加脂肪酶和豬脂肪酶對照以進(jìn)行比較。從單因素方差分析，結(jié)果顯示R平方為0.9980，均值之間存在顯著差異(p<0.05)。這意味著可以根據(jù)記錄的最高值來選擇值。然而，我們觀察到脂肪酶并沒有因活性炭上的固定而增強(qiáng)，盡管活動(dòng)保持在80%左右。然而，在A1和A2中觀察到最高的紅色陰影。

　　圖2：(a)固定在A1至A13的活性炭樣品上后，脂肪酶的相對活性。數(shù)據(jù)以95%的置信區(qū)間(誤差線)呈現(xiàn)。(b)固定在活性炭樣品上后豬脂肪酶的相對活性從A1到A13。

　　浸漬比效應(yīng)

　　浸漬比是影響孔隙率形成和活性炭表面積發(fā)展的主要因素之一。圖3顯示了活化劑(例如NaOH)與其他的浸漬比。在600℃的碳化溫度和90分鐘的碳化時(shí)間下，研究了浸漬比(IR)對脂肪酶固定化的影響。在不同的浸漬比下，與脂肪酶相比，豬脂肪酶活性得到增強(qiáng)。在400℃時(shí)，活化對Teller(BET)表面積以及總孔體積的原材料比例的影響更為明顯。在低活化溫度下，活化劑與生物質(zhì)的比例會顯著影響B(tài)ET表面積、微孔體積和微孔表面積。此外，豬脂肪酶活性在0.5浸漬比(A10)時(shí)記錄到最高值。當(dāng)浸漬比較高時(shí)，更多的Na分子擴(kuò)散到孔隙中，使孔隙變大并形成大孔隙，這不適合酶固定化，可能會對反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，活化機(jī)制通過增加浸漬比在孔隙生長中起著至關(guān)重要的作用，從而導(dǎo)致BET表面積和孔隙體積持續(xù)增加。

　　圖3：與游離酶相比，浸漬比(活性炭A3和A6–A9)對兩種固定化脂肪酶(脂肪酶和豬脂肪酶)相對活性的影響。

　　活性炭在水中增強(qiáng)脂肪酶催化反應(yīng)究中，從活性炭的制備再成功地用于固定脂肪酶和豬脂肪酶。基于丙氨酸的DES首次用作增強(qiáng)酶活性的共溶劑。結(jié)果表明，活性炭可以顯著提高豬脂肪酶的酶活性，表現(xiàn)優(yōu)于脂肪酶。發(fā)現(xiàn)和結(jié)論證明使用活性炭和低共熔溶劑的固定方法是潛在實(shí)施的理想選擇，特別適用于生物技術(shù)應(yīng)用。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)顯示，與純豬脂肪酶和用活性炭低共熔溶劑介質(zhì)固定的脂肪酶相比，用活性炭固定化豬脂肪酶的催化活性分別高兩倍和四倍。這些發(fā)現(xiàn)和結(jié)論證明使用活性炭和低共熔溶劑的固定方法是潛在實(shí)施的理想選擇，特別適用于生物技術(shù)應(yīng)用。

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